rezultate |
Impactul rezultatelor obtinute | Diseminarea rezultatelor obtinute |
Impactul rezultatelor obtinute, cu sublinierea celui mai semnificativ rezultat obtinut cu impact demonstrabil (etapa 2012)
In aceasta etapa a proiectului s-au adus contributii la studiul structurii geometrice si electronice, ca si a reactivitatii unor complecşi metalici ai unor metale cu potenţială utilitate biomedicală (Pt, Pd, Re, Mo, Fe) şi a unor compuşi organici a caror relevanta biologica este directa sau implicita prin metaboliti sau precursori ai acestora (structuri complexe bazate pe fenotiazine si pe alte heterocicluri, liganzi pe baza de sulf, azot fosfor, arsen). De asmenea, s-au studiat centri metalici din metaloenzime si modele ale acestora, care prin rolul jucat in semnalizare si stres oxidativ sunt implicate/implicabile in mecanisme de actiune biologica relevante pentru proiect. Printre acestea s-au numarat si reactii implicand compusi de sulf din clasa celor care aduc sulfhemoglibinemia, dar si implicand cobalaminele, urmarindu-se aspecte de chimie coordinativa, izomerie de legatura sau electronica, modalitati de formare si rupere de lagaturi prin mecanisme homo- si heterolitice. Din punct de vedere metodologic, in ceea ce priveste modelarea moleculara s-a explorat tehnici care anterior nu fusesera explorate in asemenea detaliu in tara noastra in special dinamica ab initio pe sisteme de metale tranzitionale complexe si tehnicile QM/MM pe sisteme de stari de spin superioare. S-a studiat efectul compusilor de referinta pe baza de platina si a compusilor experimentali asupra structurii si reactivitatii unor metaloproteine cu implicare in stresul oxidativ si asupra celulelor rosii intacte. S-au identidficat astfel noi modalitati prin care aceste medicamente pot induce efecte secundare, dar si modalitati de contracarare a acestora. In cazul compusilor organici continand unitati fenotiazinice, s-au pus in evidenta radicali formati in urma interactiunii cu hemoglobina, al caror studiu prin spectroscopia RES a relevat forme atipice prin relatie cu radicalii deja cunoscuti in literatura pentru fenotiazine; cu aceasta ocazie s-a elaborat un nou protocol de punere in evidenta a radicalilor fenotiazinici, implicand oxidare de tip enzimatic in conditii blande, urmata de inghetarea rapida a probei si masurarea la temperatura azotului lichid. De asemenea, s-au sintetizat si derivati proteici cu posibile activitati biologice. Procesele redox studiate in aceste contexte au permis validarea, printr-un set de experimente inca nepublicate, a trei metode noi de evaluare a reactivitatii implicand radicalii liberi in compusi de sinteza si in extracte naturale. Este vorba de utilizarea tehnicii RES direct asupra extractelor etanolice, de o metoda UV-vis de masurare a capacitatii antioxidante prin inhibitie competitiva asupra reactivitatii ascorbat peroxidazice a hemoglobinei, si de o metoda de masurare a reactivitatii prooxidante implicand hemoglobina si lacaza.Fata de clasele de compusi a caror sinteza si caracterizare a fost raportata in anii trecuti cercetarile au fost extinse in directia compusilor cu unitati de ferocen, in vederea obtinerii de compusi cu relevanta biologică (compusi testati pe diverse linii celulare) cum ar fi 2-arilideneferoceno[e]ciclohexanone si derivativi de 3-aril-3,3a,4,5-tetrahidroferoceno[g]indazol si complecsi de platina si paladiu ai 10-Etil-4-difenilfosfin-fenotiazinei. Pe langa studiul unor noi compusi metalici cu potential biologic, s-a trecut la o noua faza a studiului metalomic, aceea de a corela fenomenul de up-take celular al metalului cu mecanismele de combatere a chimiorezistentei la medicamente si elucidarea cailor de semnalizare aparute in celulele tunorale si normale tratate cu complecsi de platina, paladiu si galiu. Reducerea toxicităţii compuşilor organometalici cu activitate citostatică ar putea fi realizată prin utilizarea concomitentă a ciclodextrinelor şi a unor compuşi cu activitatea regenaratoare, cum sunt flavonoidele, care ar putea contracara parţial efectele toxice ale compuşilor organometalici. A fost elaborate metode analitice pentru determinarea conţinutului de Pt şi Ga din: ţesuturi, culturi şi extractelor celulare sau fracţii celulare şi au fost executate analize pe probe recoltate prin biopsiere de eşantioane de ţesut tumoral respectiv sânge integral prin venopuncţie de la paciente cu carcinom de col uterin stadiile I si II, aflate sub tratament chimioterapeutic care include perfuzii cu Cisplatin. S-a determinat cantitatea de Pt din probele biologice pentru a evidenţia daca în urma tratamentului a avut loc up-take-ul celular al Pt în ţesutul tumoral, şi s-a stabilit concentraţia metalului regăsit în ţesut după 24 de ore de la administrarea perfuziei. De asemenea s-a evaluat concentraţia de platină în sângele periferic la acelaşi interval de timp, ceea ce reflectă clearance-ul medicamentului din organism. Datele obţinute s-au corelat cu expresia unor molecule implicate în angiogeneza tumorală, determinate din aceleaşi eşantioane de material biologic, pentru a stabili posibile legături intre magnitudinea inserării platinei în celula tumorală şi inhibiţia neoangiogenezei, ceea ce constituie un factor de prognostic important al tratamentului. De asemenea, se vor face corelări între valorile de concentraţie a Pt obţinute în materialul biologic şi evoluţia clinică a pacientelor.S-a urmărit efectul biologic in vitro asupra celulelor tumorale a doi complecsi de galiu Pentru a dovedi implicarea compuşilor sintetizaţi în sensul pătrunderii intracelulare la culturile A2780 si A2780cis tratate s-au determinat concentraţia de galiu din celulele tumorale. S-a constatat că înglobarea galiului este proporţională cu durata tratamentului, înglobarea este cumulativă, este dependenta de (i) natura substituenţilor complecşilor, si (ii) este semnificativ diferită la celulele sensibile fata de cele rezistente la care înglobarea galiului în interiorul celulei este cu o unitate de măsură mai mare. Acest fenomen stă la baza contracarării chimiorezistenţei celulelor, a căror creştere este semnificativ inhibată de acţiunea noilor compuşi cu metal central Ga. Inglobarea unor cantitati mult mai mari de galiu la tratamentul cu compusul 2 duce la aparitia unor leziuni ADN mai semnificative, localizate la 8-oxoguanina, pirimidine oxidate, metiladenina. Prin metoda PCR s-a pus in evidenta capacitatea celor doua substante de a modula expresia genelor implicate in rezistenta la medicamente: TGF-β1, Bcl-xL si FasLigand. S-au continuat cercetatarile cu studiul in vivo al efectelor administrarii complecsilor de galiu. Au fost urmarite, pe animale de laborator (şobolani linia Wistar), modificarile induse după administrarea prin injectare intraperitoneala asupra homeostaziei constantelor hematologice corepunzatoare celulelor rosii, celulelor albe şi plachetelor sanguine.Au fost studiate unele modificari specifice chimiei clinice: proteinele si albuminele, unele enzime (GOT, GGT, fosfataza alcalina) - interesand functia hepatica precum si acidul uric, creatinina si compusi azotati proteici interesand funcţia renală. S-a determinat concentratia Ca şi Mg din sange. Investigatii speciale au urmărit "metalogramele" unor organe: ficat, rinichi, creier. S-au urmărit modificările matinale si vesperale, în acest regim facandu-se si administrarea intraperitoneală a compusilor respectivi in conditiile cercetarilor in vitro. Evaluarea comparativa efectelor in vitro şi in vivo este in curs. Există cercetări în curs de finalizare asupra metalogramelor din organe (ficat, rinichi, creier) după experimente efectuate cu cis-platina pentru studiul comparativ cu rezultatele obtinute pentru compusii de Ga. S-a studiat actiunea unor compusi naturali in combinatie cu iradierea si tratamentul cu medicamente standard platinice. Pe baza evaluarii gradului de lezare al ADN-ului celulelor tratate, a speciilor reactive de oxigen si apoptozei timpurii aparute ca urmare a iradierii celulelor, s-a ajuns la concluzia ca extractele naturale au efect fotoprotector si pot influenta tratamentul radiochimioterapic. Echipele implicate in acest proiect interdisciplinar au in componenta tineri cercetatori. Valorificarea rezultatelor cercetarilor originale ale studentilor doctoranzi participanti in proiect este ilustrata in cele sapte teze de doctorat finalizate si sustinute public.
Impactul rezultatelor obtinute, cu sublinierea celui mai semnificativ rezultat obtinut cu impact demonstrabil (etapa 2011)
O serie de noi meso-bis(fenotiazin-3-il)-porfirine si compusi coordinativi ai acestora cu metale, potential activi in terapia fotodinamica, au fost testate in vitro pe linii celulare de tip keratinocyte HaCaT si epidermoid A431 prin iradierea cu lumina rosie (λ= 615-630 nm) si albastra (400-505 nm). Porfirinele testate biologic au fost investigate electrochimic - masuratori de voltametrie ciclica si square wave (SW) voltammetry in vederea corelarii potentialelelor de reducere si oxidare cu comportatrea lor fata de mioglobina, hemoglobina si intercalarea lor in pTZ57R ADN. Alte rezultate deosebite au fost obtinute in urma testelor de intecalare in ADN de tip pTZ57R, a aminelor fenotiazinice si bazelor Troger (BT) cu unitati fenotiazinice. Prin electroforeza in gel s-a pus in evidenta ca cele doua clase de substante, se intercaleaza in ADN-ul plasmidic producand modificarea geometriei macromoleculeculelor de ADN. Interactiunea dintre CT ADN si BT a fost demonstrata si prin modificarea valorii rotatiei optice a diastereoizomerilor BT in urma interactiunii cu ADN.Complecsii cu Ga avand ca si liganzi derivati fosfino-ariltiolici sintetizati in cadrul grupului au activitatea antiproliferativa promitatoare, studiile urmand a fi extinse si pe omologii cu arsen. S-au sintetizat si caracterizat o serie de difosfaalchenilgermilenele si difosfaalchenilstanilenele, compusi cu situri multiple de coordinare: centrul metalic divalent Ge(II) sau Sn(II), respectiv legaturile duble P=C si atomii de fosfor. Coordinarea (NHC)Ge(Mes*P=CCl)2 la W, Mo si Au se realizeaza fie bidentat in cazul W si Mo atomul de Ge(II) si prin unul din cei doi atomi de fosfor, celalalalt atom de fosfor ramanand "pendant", fie monodentat prin atomul de Ge in cazul aurului. Studii la nivel HF/6-31G(d) pe tio-calix[n]arene n = 4,6, in prezenta si in absenta ionilor Li+,Na+, Cs+, Ca2+ si Ba2+ au vizat marimea cavitatii si modul in care proprietatile electronice ale sistemului host/guest influenteaza capacitatea de transport a calixarenelor. S-au adus contributii la studiul structurii geometrice si electronice, ca si a reactivitatii unor structuri metalice, organometalice si organice a caror relevanta biologica este directa sau implicita prin metaboliti sau precursori ai acestora. De asmenea, s-au studiat centri metalici din metaloenzime si modele ale acestora, care prin rolul jucat in semnalizare si stres oxidativ sunt implicate/implicabile in mecanisme de actiune biologica. Sistemele au inclus centri de Fe, Cu, Co, Mo, Pt, Pd, Au, si liganzi de tip aminoacid (proteine, peptide, ex. bleomicina), heterocicli (ex. porfirine, porfirazine si ftalocianine), derivati de bor. S-a studiat efectul compusilor de referinta pe baza de platina (cisplatina, carboplatina, oxaliplatina) asupra structurii si reactivitatii unor metaloproteine cu implicare in stresul oxidativ, trecand apoi la validarea rezultatelor prin confirmarea acestor efecte si asupra celulelor intacte (studiindu-se deocamdata celule din sange, in special hematii, dar si E. coli). S-au identidficat noi modalitati prin care aceste medicamente pot induce efecte secundare, dar si modalitati de contracarare a acestora. S-au testat efectele compusilor nou-sintetizati asupra acelorasi sisteme unde compusii de referinta au dat rezultate, evidentiindu-se diferente in reactivitate care se pot partial corela cu elemente de structura, ca de exemplu sterice sau de hidrofobicitate precum si derivati proteici cu posibile activitati biologice. Pentru elucidarea mecanismelor de actiune a derivatilor organometalici si coordinativi s-a evaluat activitatea biologica a unor complecsi de Pd-curcumina; pe baza evaluarii citotoxicitatii s-a stabilit ca ele au o actiune selectiva statistic semnificativa aspra celulelor studiate, fiind mai toxice fata de liniile tumorale in vitro, decat fata de cele normale. O comparatie a efectului antiproliferativ al curcuminei si a doi complecsi de Pd-curcumina a fost facuta asupra celulelor tumorale de cervix uterinHeLa, de carcinom colorectal Colo, stem tumorale hepatice CSC, melanom malign cu grad inalt de metastazare M1/15, keratinocite normale HaCaT si limfocite normale umane. S-a constatat ca datorita efectului dual de inhibitie selectiva a proliferarii tumorale si a stimularii sistemului imun in raspunsul antitumoral, complecsii de Pd ai curcuminelor au potential de terapie adjuvanta in schemele de tratament al cazuisticii maligne. In vederea elucidarii mecanismelor celulare si moleculare de rezistenta fata de tratamentul cu substante chioterapeutice s-au investigat celule de adenocarcinom colorectal HT-29R si Colo320R care au dobindit rezistenta fata de tratamentul cu oxaliplatin. Imaginile microscopice ale liniilor Colo320 (a), Colo320R (b), HT-29 (c) si HT-29R arata modificarile morfologice survenite ca urmare a dobindirii rezistentei la platina: cele rezistente devin fusiforme, se observa tranzitia de la fenotipul epitelial la cel mezenchimal prin prezenta pseudopodelor si pierderea polaritatii celulei, care duc la scaderea aderentei si cresterea distantei intercelulare in cultura. Fata de celulele sensibile la platina, cele rezistente prezinta un tablou celular si molecular diferit, sunt deosebite morfologic, din punct de vedere al citotoxicitatii, al puntilor formate de ADN-ul celular cu platina, si cel mai important: au un profil de expresie al genelor specifica, mai ales in ceea ce priveste genele responsabile de inhibitia apoptozei si proliferarea celulara. Transcriptia ADN si replicarea celulara este afectata. In cadrul studiilor in vivo s-a urmarit efectul medicamentelor platinice luand ca reper doua tinte majore ale actiunii acestora in organismul uman: incorporarea in celula tumorala primara si actiunea asupra markerilor de suprafata ale celulelor tumorale si normale. In vederea determinarii nivelului Pt din tesutul tumoral si singele circulant s-a constituit o banca de material biologic. S-a studiat exprimarea unor gene si receptori pe limfocitele pacientelor tratate cu medicamente platinice, cu ajutorul unei metode de PCR semicantitativ. Ca si tinta s-a ales gena GITR din familia TNF, a factorilor de necroza tumorala, care are doua variante implicate in raspunsul imun antitumoral: varianta 1 si 3. Amorsele utilizate la PCR au fost proiectate astfel încât să se excludă posibilitatea amplificării ADN-lui genomic şi să permită amplificarea diferitelor variante ale ARN. Prin această metodă s-au identificat mai multe variante ale genelor dintre care GITR var1 si GITR var3. Limfocitele recoltate de la subiectii supusi chimioterapiei cu cisplatin exprima in majoritatea cazurilor gena GITR, in toate cazurile a fost preezenta varianta 1, intr-un singur caz fiind exprimata si varianta 3. Pentru limfocitele si macrofagele umane tratate cu substante platinice s-a analizat modularea exprimarii unor markeri de suprafata ai macrofagelor din infiltratul tumoral sub actiunea compusilor de platina de uz clinic si compusilor metalici nou sintetizati. Pe macrofagele infiltrate izolate din lichidul ascitic provenit de la un caz de carcinom de colon , tratate in vitro cu cisplatin, oxaliplatin si carboplatin s-a determinat expresia CD40 Ligand/TNFSF5 si CXCL10/IP-10, molecule implicate in raspunsul imun antitumoral si in inflamatie. S-a studiat efectul medicamentelor consacrate pe baza de Pt asupra subpopulatiilor limfocitare prin evaluarea cantitativa a metaloproteazelor MMP2 si MMP9, implicate in semnalizarea celulara. Rezultatele arata o puternica capacitate a celulelor tumorale de a secreta metaloproteaza 2, implicata in inflamatie, ca urmare a tratamentului cu cisplatin, pe cand metaloproteaza 9 este slab exprimata. Alte studii in vivo efectuate pe un lot de sobolani Wistar au indicat efecte secundare ale administrarii de substante organometalice precum: afectarea zonei gastrointestinale, a rinichilor, hipomagneziemia, hipokaliemie şi hipocalcemie. Echipele implicate in acest proiect interdisciplinar au in componenta si masteranzi, doctoranzi si doctori in chimie a caror contributie este importanta, atat din punct de vedere stiintific, in formarea lor ca specialisti cat si la crearea unei perceptii diferite a valoarii sociale si economice a activitatii de cercetare si a importantei muncii in echipa.